KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI (HPLC, High Performance Liqid Chromatography)

Kromatografi adalah teknik pemisahan campuran berdasarkan perbedaan distribusi dari komponen-komponen campuran tersebut diantara dua fase, yaitu fase diam (padat atau cair) dan fase gerak (cair atau gas.

HPLC adalah alat yang sangat bermanfaat dalam analisis. Bagian ini menjelaskan bagaimana pelaksanaan dan penggunaan serta prinsip HPLC yang sama dengan kromatografi lapis tipis dan kromatografi kolom. HPLC secara mendasar merupakan perkembangan tingkat tinggi dari kromatografi kolom. Sampel sedikit, dapat di lihat secara kuantitatif, dapat dihitung secara kualitatif, dapat terpisah.

Prinsip kerjanya: sampel disuntikkan, dilewatkan fase gerak. Dalam detector di terjemahkan, kemudian direkam oleh rekorder.

KCKT

  • Sistem pemisahan dengan kecepatan dan efisiensi yang tinggi. Karena didukung oleh kemajuan dalam teknologi kolom, sistem pompa tekanan tinggi, dan detector yang sangat sensitif dan beragam.
  • KCKT mampu menganalisis cuplikan secara kualitatif maupun kuantitatif, baik dalam komponen tunggal maupun campuran,.
  • KCKT merupakan teknik pemisahan yang diterima sangat luas untuk analisis dan pemurnian senyawa tertentu dalam suatu sampel pada sejumlah bidang antara lain : farmasi, lingkungan, dan industry makanan.

Kegunaan umum :

Analisis senyawa yang tidak mudah menguap (nonvolatil) menetapkan kadar senyawa tertentu sepeti ; asam-asam amino, asam-asam nukleat, dan protein dalam cairan fisiologis, menetukan kadar senyawa-senyawa aktif obat, dll. Beberapa senyawa organic yang mudah terurai (labil) karena KCKT dilakukan pada suhu kamar. Selain senyawa organic, juga dapat mengananlisis senyawa anorganik, cuplikan yang mempunyai berat molekul tinggi atau titik didih tinggi, sperti polimer.

Analisis kuantitatif didasarkan pada pengukuran luas/area puncak analit dalam kromatogram, dibandingkan dengan luas/area standar.

Kelebihan KCKT antara lain :

  1. Mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran, mudah, kecepatan analisis dan kepekaannya tinggi.
  2. Menghindari terjadinya dekomposisi / kerusakan bahan yang dianalisis.
  3. Gunakan bermacam-macam detector.
  4. Kolom dapat digunakan kembali.
  5. Mudah melakukan recovery cuplikan.
  6. Instrumennya memungkinkan untuk bekerja secara automatis dan kuantitatif.
  7. Waktu analisis umumnya singkat.
  8. Kromatografi cair preparative memungkinkan dalam skala besar.

KCKT terbatas untuk identifikasi senyawa, kecuali jika KCKT dihubungakan dengan spectrometer massa (MS). Keterbatasan lainnya adalah jika sampelnya sangat kompleks, maka reesolusi yang baik sulit diperoleh.

Prinsip

Dengan bantuan pompa, fase gerak cair dialirkan melalui kolom ke detector, cuplikan dimasukkan ke fasa gerak dengan penyuntikan, di dalam kolom terjadi pemisahan komponen campuran.

Karena perbedaan kekuatan interakdsi antara solute-solut terhadap fasa diam akan keluar terlebih dahulu, sebaliknya solute-solut interaksinya kuat dengan fasa diam akan keluar lebih lama setiapnkomponen campuran yang keluar dideteksi oleh detector kemudian direkam dalam bentuk kromatogram.

Skema alat HPLC (diagram kromatografi Cairan Kinerja Tinggi atau HPLC) adalah sebagai berikut:

dua hal utama yg pnting dlm metode KCKT pertama adalah proses separasi/pemisahan. Kedua adalah proses identifikasi, hal ini mjadi factor yg sgt penting dlm kberhasilan proses analisis.

Komponen KCKT

Wadah fase gerak dan fase gerak

  1. Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert).
    Fase terbalik biasax digunakan fase diam brupa silica dimodifikasi mjadi non polar melalui pelekatan rantai2 hidrokarbon pnjang pd permukaannya scr sderhana baik brupa atom C 8 atau 18. C 18 yg dpt dgunakan u.analisa karotenoid, protein, lovastatin, dsb. Kolom yg khusus dibuat u.7an analisis tertentu, spt kolom Zorbax carbohydrate (Agilent) khusus digunakan u.analisis karbohidrat (mono-, di-, polisakarida).
    Fase gerak yg sring digunakan u.pmisahan dgn fase tbalik ad.campuran lrutan buffer dgn metanuol atau camouran air dgn asetonitril.
    Elusi dlakukan dgn
  • Cara isokratik (komposisi fase grak ttap selama elusi) atau dgn
  • cara bergradien (kompoisis fase grak berubah2 slm elusi). Elusi bergradien dgunakan u.mningkatkan resolusi cmpuran yg kompleks terutama jka sampel mempunyai kisaran polaritas yg luas. Resolusi mrupakan ukuran apakah suatu sexawa tpisah scara baik atau tidak dgn sexawa lain.

 pompa

  1. pompa dgunakan u.KCKT agara mmpu mbrikan tekanan smpai 500 psi dan mamou mgalirkan fase grak dgn kcepatan alir 3 mL/menit. U.tjuan preparatif pompa yg hrus dgunakan hrus mampu mgalirkan fase grak dgn kcepatan 20 mL/menit.

 t4 pnyuntikan

smpel2 cair dan lrutan disuntikkan scr lgsg k dlam fase grak. Kmudian akan mnju ke kolom jika diputar

Kolom n fase diam

2 jnis kolom pd KCKT yaitu kolom konvensional dan kolom mikrobor. Kolom mrupakan bgian KCKT yg mana tdapat fase diam u.blangsungx proses pmisahan solute/analit. Kolom mikrobor mmpuxai keuntungan yg utama dibanding kolom konvensional yakni konsumsi fase grak kolom mikrobor hax 80% atau lbih kcil, pd kolom mikrobor kcepatan alir.x lebih lambat .

 Detector

Pux respon yg cpat dn reproduksibel (klau kmbli msih tdeteksi pada area itu). Sensitive (bsa mdeteksi dgn baik sampel yg sgt kecil), stabil. Sbaikx signal yg dihasilkan bbnding lurus dgn konsentrasi sampel pd kisaran yg luas (klau mis.x scr phitungan kdarx = kdar dgn phitungan). Tdak peka thadap suhu. 2 detektor: deterktor umum (tdk spesifik n tdak selektif), mis.x detektor indeks bias dn spektrometri massa. Detector spesifik n selektif, spti UV-VIS, flouresensi, yg menghantar atau elektrokimia.

Scr kualitattif krom, Tr (time retention/waktu retensi) slalu konstan (stiap kta mlakukan analisis, kromatogram sama u.identifikasi sama). Mnentukan 2 puncak scr proporsional dgn jmlah sampel yg diinjeksi dan dpt dgunakan u.mghitung konsentrasinya (scra kuantitatif).

Klo ada sampel, mis.x parasetamol yg diinject (konsentrasi, Tr-nya, luas area) à standar. Jika diperoleh data yg mdekati standar, maka ada hipotesis awal. Kmudian dibuatlah pers.regresi dgn cara, smua data dirata2kan. Sub.ke pers.regresi y = ax+ b. x= pers.regresi (ppm).

*Sumber: Materi kuliah yang dibawakan oleh Dra. Hasri, MSi

Iklan

Tinggalkan Balasan

Isikan data di bawah atau klik salah satu ikon untuk log in:

Logo WordPress.com

You are commenting using your WordPress.com account. Logout / Ubah )

Gambar Twitter

You are commenting using your Twitter account. Logout / Ubah )

Foto Facebook

You are commenting using your Facebook account. Logout / Ubah )

Foto Google+

You are commenting using your Google+ account. Logout / Ubah )

Connecting to %s